REFERENCES

Spatial Transcriptomics References Index

為 ST Interactive Tutorial 15 個章節提供原始論文、官方文件、benchmark 與資料集的完整佐證——含 Visium / Visium HD / Xenium / MERFISH / CosMx / Slide-seq / Stereo-seq 平台與全套分析工具。

References, citations, and sources for the Spatial Transcriptomics Interactive Tutorial — papers, official documents, and benchmarks with DOI / URL links.

概覽

如何使用這份資料？

本頁針對教學中提到的每個工具、演算法與生物學概念，整理學術出處供讀者深入查閱。引用標籤含義：

For every tool, algorithm, and biological concept mentioned in the tutorial, this page collects academic sources for deeper reading. Citation tag meanings:

📄

Paper

原始論文 · 含 DOI / PubMed

Primary papers with DOI / PubMed

📘

Doc

官方文件、vignette、tutorial

Official documentation, vignettes, tutorials

⭐

Best Practice

系統性綜述或 community 推薦

Systematic reviews and community-recommended practices

📊

Benchmark

方法評比 / 獨立 benchmarking

Method comparisons and independent benchmarking

🗄️

Database

公開資料集 / atlas

Public datasets and atlases

📚

Book

線上免費書籍與綜合教材

Free online books and comprehensive textbooks

本頁目錄

★Best Practices 綜述 ★核心分析框架 Step 1總覽 Step 2平台比較 Step 3品質管控 (QC) Step 4標準化 Step 5降維 Step 6空間區域 Step 7SVGs Step 8解卷積 Step 9scRNA 整合 Step 10細胞通訊 Step 11Niche 分析 Step 12空間軌跡 Step 13多樣本整合 Step 14細胞切割 Step 15HD / Histology DB公開資料集 / Atlas !教學註記與細節
綜論

⭐ Best Practices 綜述論文

整體 ST 分析流程的權威性綜述與線上書籍。建議從這幾篇開始建立全景觀。

Authoritative reviews and online books covering the full ST analysis workflow. Start with these to build a panoramic view.

核心框架

🧰 核心分析框架

ST 分析的軟體生態系：Seurat (R)、Scanpy (Python) 各自有專屬 spatial 模組；Squidpy 是 Scanpy 的 spatial 擴充；SpatialData 提供統一資料容器；Giotto 是 R 端較完整的 spatial 套件。

The ST analysis software ecosystem: Seurat (R) and Scanpy (Python) each have dedicated spatial modules; Squidpy is the spatial extension for Scanpy; SpatialData provides a unified data container; Giotto is the more comprehensive spatial package on the R side.

Step 1

🌐 總覽 (Overview)

Step 2

🔬 平台比較 (Platforms)

平台選擇與綜合比較

個別平台原始論文

Step 3

🧪 品質管控 (Quality Control)

Step 4

⚖️ 標準化 (Normalization)

Step 5

📉 降維與特徵 (Dimensionality Reduction)

Step 6

🧩 空間區域辨識 (Spatial Domains)

主流方法

Benchmark

Step 7

✨ 空間變異基因 (Spatially Variable Genes)

Step 8

🧬 細胞類型解卷積 (Deconvolution)

Step 9

🔗 與 scRNA-seq 整合 (sc-Spatial Integration)

Step 10

💬 空間細胞通訊 (Cell-Cell Communication)

Step 11

🏘️ 生態棲位 (Niche & Microenvironment)

Step 12

🛤️ 空間軌跡 (Spatial Trajectory)

Step 13

🧱 多樣本整合與 3D 重建 (Multi-sample / 3D)

Step 14

✂️ 細胞切割 (Cell Segmentation)

Step 15

🖼️ Visium HD 與病理影像整合 (HD & Histology)

Visium HD 工作流程

H&E 影像與 vision-omics

資料庫

🗄️ 公開資料集 / Atlas

教學註記

📌 教學註記與細節

下方為閱讀本 Spatial Transcriptomics 教學 HTML 與本 reference 比對後，發現的可能不完整、易誤解或可加強之處。不修改原教學檔案，僅在此說明以利參照。

Below are points discovered while cross-checking the tutorial HTML against this reference list — places that may be incomplete, easily misread, or worth expanding. The original tutorial files are not modified; clarifications are provided here for cross-reference.

補充說明 · Notes

Visium spot ≠ single cell：解析度的真實意義

教學以 10x Visium 為 spatial transcriptomics 入門平台。需釐清關鍵概念：標準 Visium 的 55 μm spot 在大多數組織內覆蓋 1–10 個細胞，並非單細胞解析度。實務影響：(1) 一個 spot 的表達 profile 是 多細胞混合訊號，cluster 直接對應「組織區域」而非「細胞型別」；(2) 後續若要解構成 cell-type proportions，必須做 deconvolution（cell2location、RCTD、SpatialDWLS）；(3) Visium HD (2024) 將 capture 縮至 2 μm bin，可近似 subcellular，但需 binning 至 8/16 μm 才有穩定 UMI 數；單細胞解析度仍以 Stereo-seq、Slide-seqV2、Xenium 較直接。Ståhl et al. 2016 Science 353:78（原始 ST 技術）。

補充說明 · Notes

MERFISH / Xenium（imaging）vs Visium / Slide-seq（sequencing）

教學常將「spatial transcriptomics」當成一個技術類，實則 分為兩大典範，資料屬性與分析流程根本不同：
(1) Sequencing-based（NGS 讀出）—Visium、Slide-seq、Stereo-seq、HDST、DBiT-seq：對 capture spot/bead 上 RNA 加 spatial barcode 後 cDNA → NGS；覆蓋全轉錄組（~20k 基因，untargeted），但解析度受 spot 大小限制（2–100 μm），每個位點 UMI 計數低；下游近似 scRNA-seq matrix。
(2) Imaging-based / single-molecule FISH—MERFISH、seqFISH+、10x Xenium、Vizgen MERSCOPE、NanoString CosMx：用 targeted probe panel (100–1000 基因) + 多輪 hybridization 顯微鏡讀出，提供 真正 subcellular (~100–300 nm)、單分子計數、但僅限預選基因。
影響：(a) imaging-based 不適合 hypothesis-free 探索新 marker；(b) sequencing-based 不能談 subcellular localization；(c) cell segmentation 在 imaging-based 是核心問題（Baysor / Cellpose），sequencing-based 則做 deconvolution。Chen et al. 2015 Science 348:aaa6090（MERFISH）; Janesick et al. 2023 Nat Commun 14:8353（Xenium）。

補充說明 · Notes

Deconvolution：cell2location vs RCTD vs SpatialDWLS

由於 Visium spot 為多細胞混合，deconvolution（從 reference scRNA-seq 估計每個 spot 的 cell-type proportions）是核心後續分析。教學若僅提一種方法易誤導，三大方法取捨：
cell2location (Kleshchevnikov 2022 Nat Biotechnol 40:661)—Bayesian hierarchical model + variational inference，明確 model spot-level total mRNA count 與 technology-specific over-dispersion，估計 絕對細胞數 而非僅比例；適合稀有細胞型，需 GPU、收斂時間長。
RCTD (Cable 2022 Nat Biotechnol 40:517)—Poisson regression + constrained MLE，分 doublet/full mode，速度快、CPU 即可；單 mode 假設 spot ≤2 種 cell type，Visium 可能不適。
SpatialDWLS (Dong & Yuan 2021 Genome Biol 22:145)—weighted least squares，速度最快但對 reference imbalance 敏感。
Benchmark (Li et al. 2022 Nat Methods 19:662)：cell2location 在 cell-type detection 與絕對量化最準確；RCTD 在計算效率最佳；SPOTlight 在跨平台一致性較弱。所有方法皆 依賴 reference scRNA-seq 的細胞型涵蓋完整性，缺失型別會被強制分配給最接近者。

補充說明 · Notes

Niche / CCC：COMMOT、CellChat、NICHES 假設不可忽略

教學常以「spatial 可以做 cell-cell communication (CCC)」為賣點，但 多數 CCC 工具（CellChat、NicheNet、CellPhoneDB）原為 scRNA-seq 設計，無空間資訊，僅以 ligand–receptor 共表達推論「可能交互作用」。空間版本如：
COMMOT (Cang et al. 2023 Nat Methods 20:218)—optimal transport-based，明確將細胞間距離納入 ligand-receptor flux 推論，假設訊號為 unbalanced OT 過程、空間衰減 kernel 為 exponential；參數選擇（衰減尺度、receptor saturation）強烈影響結果。
NICHES (Raredon 2023 Bioinformatics 39:btac775)—把每對 neighboring cells 變成新 observation，便於後續 ML 分析。
共同陷阱：(1) ligand-receptor 共表達 ≠ 實際 signaling，無下游通路活化證據；(2) 訊息單向性常被忽略；(3) RNA-level 共表達 ≠ protein-level 互作（如分泌型 ligand 可能來自遠處）；(4) Visium 解析度下，spot 內訊號是混合，不能直接讀為「細胞A→細胞B」。建議與 ATAC、proteomics、實驗驗證（共培養、活體 reporter）整合。

補充說明 · Notes

Panel bias：Xenium / MERSCOPE 受限於預選基因

imaging-based 技術（Xenium、MERSCOPE、CosMx）的關鍵限制：整個實驗只能測量預先設計的 panel（通常 100–1000 基因），這直接造成 結構性 selection bias：(1) 無法發現未被 panel 包含的新 marker / cell state；(2) cell-type annotation 受限於 panel 對該型別 marker 的涵蓋程度，rare 或 transitional state 容易被 collapse 到鄰近 cluster；(3) panel 在不同組織不通用—Xenium Human Breast panel 用在腎臟結果可信度大幅下降；(4) cross-panel benchmark 困難，因為兩個 panel 的基因集不重合，做 batch correction 也只能在交集上做。實務建議：(a) 先用 Visium / scRNA-seq 探索 → 再用 imaging-based 量化驗證；(b) 自訂 panel 時，需含 housekeeping、所有預期 cell type 的 ≥3 個 markers、cell-state continuum 的轉換 markers；(c) 報告必須宣告 panel composition 與設計依據。Janesick et al. 2023 Nat Commun 14:8353（Xenium breast benchmark vs Visium / scFFPE）。

補充說明 · Notes

高解析度 sequencing-based 平台對比

2023–2024 出現多個 sub-cellular sequencing-based 平台，常被混淆，技術細節對比：
Visium HD (10x, 2024)—2 μm × 2 μm capture squares 連續排列（無 gap）、推薦 binning 至 8 μm / 16 μm 分析；面積 6.5 × 6.5 mm；untargeted whole transcriptome；FFPE compatible；資料量極大（單樣本可達 TB 級 raw images + UMI matrix），需要 Space Ranger 3.0+。
Stereo-seq (BGI, Chen et al. 2022 Cell 185:1777)—DNA nanoball (DNB) chip，~220 nm spot 中心距、~500 nm spot 直徑；面積可達 cm² 級（適合整個小鼠胚胎切片）；whole transcriptome；data analysis 以 Stereopy / SAW pipeline 為主。
Slide-seqV2 (Stickels et al. 2021 Nat Biotechnol 39:313)—10 μm beads 隨機排列，解析度單細胞級但 capture efficiency 約 Visium 一半；面積較小（~3 mm puck）；2024 之後使用度下降。
取捨：(a) Visium HD 與 10x 生態整合最完整、商業支援；(b) Stereo-seq 解析度最高、適合 organ-scale 但 pipeline 較 BGI 專屬；(c) 三者皆需 binning 才能達到統計穩定 UMI；naive 2 μm bin 分析會極度 sparse；(d) FFPE support 目前 Visium HD 最成熟，Stereo-seq 主要 fresh frozen。